植物组培步骤

组织培养的步骤

一、培养基配制

配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。

自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。

1、配制几种母液

（1）配制MS大量元素母液

一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取

NH4NO3 165g KH2PO4 17g

KNO3 190g CaCl2・2H2O 44g

MgSO4・7H2O 37g

各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液

一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取

KI 0.083g Na2MoO4・2H2O 0.025g

H3BO3 0.62g CuSO4・5H2O 0.0025g

MnSO4・H2O 1.69g CoCl2・6H2O 0.0025g

ZnSO4・7H2O 0.86g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4・5H2O和CoCl2・6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取

CuSO4・5H2O 0.05g CoCl2・6H2O 0.05g

各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液

一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取

肌醇 10g 盐酸硫胺素（VB1） 0.01g

烟酸 0.05g 甘氨酸 0.2g

盐酸吡哆醇（VB6） 0.05g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液

一般配制成100倍MS铁盐母液。

依次称取

EDTA二钠 3.73g FeSO4・7H2O 2.78g

配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

所以MS母液有5种大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有机母液和MS铁盐母液，共8种母液。

激素母液的配制

各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。

2、配制培养基

以配置1L MS培养基为例，按顺序进行如下操作：

（1）先在烧杯中放入一些蒸馏水。

（2）分别取上面八种母液10ml倒入。

（3）一般称取30g蔗糖倒入，搅拌溶解。

（4）加蒸馏水用量筒定溶至1L。

（5）按设计好的方案添加各种激素，由于激素的用量很小，而且激素对组培植物的生长至关重要。所以有条件的话最好用微量可调移液器吸取，减少误差。

（6）用精密试纸或酸度计调整PH至5.7-5.8。（有条件的话使用酸度计，比较精确） 可配1当量的HCL和1当量的NaOH用来调溶液PH值。

1当量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。

1当量NaOH配制：称取NaOH 4g 配成100ml溶液。

（7）称取5g左右琼脂粉（质量好的琼脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在电炉上加热至沸腾，直到琼脂粉熔化。

（8）稍微冷却后，分装入培养容器中。无盖的培养容器要用封口膜或牛皮纸封口，用橡皮筋或绳子扎紧。

（9）放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右。

（10）灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。

一个完整的植物组织培养过程一般包括以下几个步骤：

(1)准备阶段

查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制订出切实可行的培养方案。然后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。

(2)外植体选择与消毒

选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，接种到初代培养基上。(3)初代培养

接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。

(4)继代培养

分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。

(5)生根培养

刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进小苗生根，提高其健壮度。

(6)炼苗移栽

选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫，防止病虫危害。当组培苗完全成活并生长一定大小后，即可移向大田用于生产。

高等植物的组织培养(tissue culture)技术是指分离一个或数个体细胞或植物体的一部分进行培养的技术。

通常我们所说的广义的组织培养，是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。

细胞全能性(cell totipotency):植物体的每一个细胞都携带有一套完整的基因组，并具有发育成为完整植株的潜在能力。

植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具有关键性作用。它包括:生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、脱落酸、乙烯等。

生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管苗的生根。常用的有2,4-D、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、IAA(吲哚乙酸)等。其作用强弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。

细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老，促进芽的产生等作用。常用的有Zip、KT( 氯吡脲)、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、ZT(玉米素)等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。

赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。常用的为GA3。

像这个一般灌植物这方面的东西吗？大部分他都是不懂的，因为他们只会种一些花花草草的，你可以去咨询下那些植物专家。

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